بررسی اثرات ویتامین هایE وC بر خصوصیات اسپرم گاو در محیط یخچال

مقدمه

حفظ ونگهداری سلول اسپرم در مای (5ºC) در مراکز ناباروری جهت استفاده درIVF موجب افزایش متابولیسم، کاهش قدرت باروری وتخریب آن می گردد. تاکنون . گزارشات نشان می دهند که نگهداری اسپرم طیور در محیط یخچال (5ºC) ویاآزمایشگاه برای مدت 24 تا 48 ساعت سبب کاهش باروری گردیده است

 (1) . سلول اسپرم برای ادامه حیات وابقاء قدرت باروری نیاز شدید به اکسیژن دارد

 (2) . از طرفی اسپرم نسبت به اکسیژن حاصل از پراکسیداسیون چربی حساس بوده بطوری که این امرموجب تخریب غشاء، کاهش تحرک و باروری آن می گردد

(3،4) .

دراین مطالعه ازدو نوع آنتی اکسیدان یکی ویتامین C (ascorbic acid) محلول در آب که باعث کاهش پراکسیداسیون خارج سلولی می گردد اما اثرات کمی بر غشاءسلول یا داخل سلول دارد ودیگری ویتامین E (α-tocopherol) محلول در

مواد و روش ها

دراین مطالعه مایع اسپرم از یک راس گاو سالم در لوله های مدرج جمع آوری و از نظــر حجم ، کــیفیت و رنگ مورد ارزیابی قرار گرفت. نمونه در آ ب C ْ30 قرار داده شــد. ابتدا نمونه رقــیق شد

(6).

در لوله اول ( تیمار‌1)‌ مقدار mg / ml40‌‌ ویتــامین E و در لــوله دوم ( تیمار‌2) مقدارmg / ml 200‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ ویتامین C اضافه شدند. هــر نمــونه توسط شیکر به آهســـتگی مخلوط و درºC) 5( نگهداری شـــدند. پس از 24 ساعـــت هرتیمار به 8 قسمــت مساوی تقسیم گردید(هراپندورف حاوی ml1 مایع سیمن رقیق شده با غلظت20میلیون اسپرم بود) . تعداد 2 عدد اپندورف ازهرتیماروگروه شاهـد از روز اول تا چهارم شامل :   24 E1,C1 =  48   E2,C2= 72E3,C3 =     96E4,C4 = ساعت در یـخچـال نگهـداری و برای متغیرهـای ‍pH ،TSC ، % PSM ،SNM % ، MSC ، FSC و SMI توسط دستگاه آنـالـیزاسـپـرم مدل         (, MES,Co..USA ( SQA II C-P مورد سـنجش قرار گرفتند. سه پارامتراولیه بجز pH جزﺀ معیارهای استاندارد بهداشت جهانی میباشند و شامل : (TSC) ، (%PSM) و (% SNM) هستند . سه پارامتر دیگر که در محدوده ی مراحل آنالیز نمونه تعریف می شوند شامل : MSC ، FSC واندیکس SMI که توسط آن می توان به وجود فضای آکروزومی طبیعی اسپرم پی برد و توسط معادله زیرمحاسبه می گردد (10) 20) + (% PSM) = SMI ×   (MSC

 محاسبات آماری : دادها در قالب طرح کاملا″تصادفی وبا استفاده از دستور1GLM در نرم افزار Minitab ver.13 آنالیز شد. مدل آماری دادها بصورت Xij=µ+Tj+∑ij است و میانگین صفات تحت بررسی پس از انجام تجزیه واریانس بوسیله آزمون LSD مورد مقایسه قرار گرفت(15).

نتایج

نتایج تیمارهای مختلف به صورت میانــگین گــزارش شــده اند. ارزیابـــی هر تیــمار در روزهـــای مــــختـلف(روز اول =E1 , C1 ، روزدوم = E2 , C2 ، روزســـوم= E3 , C3 و روزچــهــارم = E4 , C4 ) اندازه گیری و با گـروه کـــنترل بــرای فاکتورهای pH ، TSC ، %PSM ، %SNM ، MSC ، FSC ، SMI مقایسه شدند. ســلول های تــیمار C4 بــعلت مـرگ سـلولی مورد محاسبه قرار نگرفتند(جدول 1).

pH : اثرات ویتامین های EوC را بــر ‍pH سیـــمن در مختلف، تیمار E1 در مقایســه با کنترل افزایش و تــیمار E4 کاهش و تیمارهای , C1 2 Cو C3، E2 ، E3 تفاوت معنی داری نسبت به گروه کنترل نشان ندادند. .

درصد سلول های اسپرم متحرک نرمال (%SNM ( :

تیمارهای E1،C 1 و  E2 در مقایســـه بـا شاهد افزا یش و تــیمارهای C2 E3 و  E4تفاوتی نداشت ولی تیمار C3 نـسبت بــه گــروه کنترل کاهش معنی داری پیدا نمود.

غلظت اسپرم نرمال باحرکت پیشرونده( FSC ) :

تیمار های C1، E1و E2 درمقایسه با گروه کــنترل افــزایش معــنی داری نشـــان میدهند در حالیکه تیمار E3 تفاوتی نشان نمی دهد. اما تیمارهای C2 و C3 ، E4نسبت به گروه کنترل کاهش معنی داری پیدا نمودند.

ایندکس اسپرم متحرک : (SMI )

تیمارهایC1 ، E1و E2 افزایش معنی دار نسبت به گروه کنترل نشان مــی دهند در صورتی که تیمارهای C2، C3، E3 وE4 نسبت به گروه کنترل تفاوتی ندارند .

غلظت اسپرم های متحرک درواحد حجم ( MSC ):

     تیمارهای C1، E1 و E2 افـــزایش مـعنی دار ،اما تیمــارهــای C2، E3و E4مشابه ، در حالیـکه تیمار C3 کاهش
معنی داری نسبت به گــروه کـنتـرل دارد.

درصد اسپرم های متحرک با حرکت پیشرونده ( % PMS ) :

تیمارهای E1 و E2 افزایش در صورتـــی که تیمـارهای C2وC3 E3 و E4 تفاوت معنی داری ندارند. هم چنین روند کاهشی معنی داری بین تیمارهای C1>C2>C3    به ترتیب مشاهده گردید.

 بقیه ترجمه متن در ادامه مطلب

 غلظت سلولهای اسپرم ( TSC ) :

تیمارهای C1،E1 و E2 افزایش ، تیمــــارهـــای C2 ، E3 و E4 تفاوت معنی داری باکنترل ندارند اما تیمار C3 کاهش
معنی داری را باکنترل نشان میدهد.

جدول-1 مقایسه میانگین اثر تیمارها ی  EوC بر اساس آزمون LSD بر پارامتر های مختلف ،حروف مشترک تفاوت معنی داری ندارند (p<0.05) .

CONTROL E1 E2 E3 E4 C1 C2 C3
pH 6.750b 7.175a 6.800b 6.800b 6.475c 6.800b 6.700b 6.775b
%SNM 21.500b 29.750a 30.500a 22.000b 19.00b 27.333a 18.335b 15.300c
FSC 4.650bc 14.825a 13.900a 4.175bc 2.400c 10.125ab 1.975c 0.875c
SMI 88.00b 158.500a 166.00a 91.750b 69.750bc 137.650a 61.00bc 35.00c
MSC 10.875b 27.050a 27.500a 11.900b 6.825bc 21.675a 5.175bc 1.125c
%PMS 31.500cd 44.750a 45.500a 35.000bc 28.500cd 41.675ab 24.323d 13.325c
TSC 30.500b 57.750a 60.500a 34.000b 24.000bc 50.650a 16.675bc 8.675c

 بحث

در این مطالعه اثـرات آنــتی اکســیدانی ویتـــامین های E وC بر محافـظت سلولهای اسپرم در طی 4 روز نـــگهداری در
C ) ْ5 ( بررسی شد.

در این مطالعه درجه pH‌ در روز اول برای تیمار E1 بطور معنی دار در مقایسه با گروه کنترل افزایش نشان می دهد که خود نمایانـگر تــــثبیت pH‌ در روز اول توسط تیمار E1 است در حالی که تیمار های E2 و E3‌ تفاوت معنی داری با تیمار کنترل ندارند . تیمارE4 در روز چهارم کاهش معنی داری را نسبت به گروه کنترل نشان می دهد. درجهpH درتیمارهـــــای C1‌ ، C2 و C3 در مقایسه با تیمار کنترل تفاوتی نشان نمی دهند. به نظر می رسد که ویتامین C موجب کاهـــــش pH محــیط گردیده است و این امر در روز چهارم موجب از بین رفتن اسپرم های تیمار C شده است. همچنین ویتامین C موجب کاهش چسبندگی اسپرم به یکدیگر و در نتیجه افزایش باروری نیز می گردد( 11و5).

در این مطالعه اضافــــه نمودن ویتامــــین E‌ درصد بیشتر سلول های نرمال را در روز اول و دوم سنجش در مقایســــه با گروه کنترل بطورمعنی داری نشان می دهد ، در صورتی که در روزهای سوم و چهارم یک روند نزولی اما غیر معنی داری را نسبت به تیمار کنترل دارد. گزارش شده است که کمبود ویتامینE در جیره غذایـی حیوانات موجـب عقیمی می گردد (12) .

     در این تحقیق، درصد سلول های اسپرم نرمال که دارای حرکت پیشرونده بودند بعد از 48 ساعت ذخیره در تیمار های E1 و E2 بطور معنی داری نسبت به گروه کنترل افزایش نشان می دهند که این امر نشانگر اثرات بالقوه ویتامین E در حفظ و نگهداری اسپرم است. اما دیگر یافته ها بالعکس افزایش تحرک اسپرم ها را گزارش نموده اند(8). افزودن ویتامین C در 24 ساعت اول موجب پایداری تحرک سلول های نرمال گردید اما در روزهای دوم و سوم تحرک اسپرم بطور معنی داری کاهش یافت.که این امر نمایانگر اسیدی شدن محیط در مقایسه با روز اول است و سلول اسپرم در محیط با pH اسیدی فعالیت خود را از دست داده و می میرد.

سایرمطالعات نشان میدهند که ، پراکسید آلی در طی ذخیره اسپرم قوچ تشکیل میشود و تجمع آن موجب از دست رفتن تحرک اسپرم می گردد (13) . در این مطالعه ویتامین C در مقایسه با ویتامین E اثرات کمتری در حفظ ، نگهداری و تحرک اسپرم دارد. مطالعات اخیر گزارش نموده اند که افزودن ویتامینC به محلول اسپرم ممکن است به عنوان پرواکسیدان عمل کند تا آنتی اکسیدان (9) .

دراین مطالعه ،ایندکس تحرک اسپرم (SMI ) برای تیمارهای E1 و E2 در مقایسه با گروه کنترل افزایش معنی داری در 48 ساعت اول ذخیره اسپرم نشان می دهد در حالی که در روزهای سوم و چهارم ( E3 , E4 ) تفاوت معنی داری ندارند. مشابهاً سایر مطالعات در 24 ساعت اول ذخیره ی اسپرم بوقلمون ،تفاوت معنی دار مشاهده نمودند (25). در این مطالعه تیمار C1 موجب افزایش SMI در مقایسه با گروه کنترل گردید؛ در حالیکه در روز دوم تفاوتی با گروه کنترل نشان نمی دهد.تیمار C3 در روز سوم یک کاهش معنی دار نسبت به کنترل را نشان می دهد که بیانگریک روند کاهشی در مقایسه با تیمارC1 در 24 ساعت اول
می باشد.

درصدغلظت اسپرم های متحرک پیشرونده در تیمار های E1 و E2 بطور معنی داری در مقایسه با گروه کنترل افزایش نشان میدهد که این امربیان گر درجه باروری بالا می باشد. بطوری که گزارش شده است ، افزودن ویتامینE به سیمن خروس موجب بهبود باروری بعد از 24 ساعت ذخیره در مقایسه با کنترل می شود (14) . در روزهای سوم و چهارم ذخیره ی اسپرم E4 E3 ، درصد ( % PMS ) تفاوتی با گروه کنترل نشان نمی دهند که این یافته تاثیرگذاری مثبت ویتامین E حداقل برای اولین 48 ساعت نگهداری را نشان می دهد. همچنین تیمار C1 درصد بیشتر PSM را در مقایسه با گروه کنترل نشان می دهداما در روزهای دوم و سوم ذخیره اسپرم روند کاهشی را نسبت به گروه کنترل پیدامی کند که خود نمایانگر تاثیر مثبت ویتامین C بر حفاظت اسپرم در 24 ساعت اول ذخیره است.

درصد سلول های اسپرم متحرک نرمال با ساختار طبیعی (%SNM) در تیمارهای E1 ، E2 و C1 بطور معنی دار در مقایسه با گروه کنترل افزایش نشان می دهند. این یافته نشانگر عملکرد مثبت این آنتی اکسیدان ها در حفظ ساختار مرفولوژیکی و فعالیت فیزیولوژیکی سلول های اسپرم می باشد، اگرچه اثرات آنتی اکسیدانی در تیمارهای E3 , E4 , C2 و C3 روند کاهشی را نشان می دهند. همچنین گزارش شده است که آنتی اکسیدان E قادر است زمان ماندگاری اسپرم بوقلمون را در آزمایشگاه افزایش
دهد (15).

نتیجه گیری

نتایج کلی بدست آمده ازاین مطالعه نشان می دهند که افزودن mg /ml 40 ویتامین E به مایع اسپرم در محیط یخچال سبب ارتقاء خصوصیات اسپرم حداقل برای دو روز اول نگهداری در مقایسه با گروه کنترل می شود. همچنین خاصیت آنتی اکسیدانی ویتامین E موجب حیات اســــپرم تا روز چهارم نیز گردید. استفاده ازmg / ml200 ویتامین C نیز سبب ارتقاء خصوصیات اسپرم تا روز دوم نگهداری درمقایسه با گروه کنترل گردید اما در روز دوم تفاوت معنی دار بین دو گروه مشاهده نگردید . به نظر میرسد که خاصیت آنتی اکسیدانی ویتامین E در حفظ و نگهداری اسپرم در شرایط این مطالعه موثر تر از ویتا مین C میباشد. بنا براین پیشنهاد می شود که برای مقابله با انواع اکسیژن مخرب درمحیط اسپرم در شرایط آزمایشگاهی بهتراست از ویتامین E در رقیق کننده های اسپرم استفاده گردد.

تشکر و قدردانی

منابع مالی این طرح توسط قطب علمی گروه علوم دامی دانشکده کشاورزی دانشگاه فردوسی مشهد تامین گردیدومایع اسپرم از مرکز تحقیقات عباس آباد جهادکشاورزی استان خراسان رضوی تهیه شد که بدینوسیله مراتب تشکر وقدردانی بعمل می آید.